多聚甲醛固定,確實(shí)是老生長(zhǎng)談,很多研討生在做實(shí)驗(yàn)時(shí),可能很多師兄師姐都讓他們用多聚甲醛固定,有些可能是為了長(zhǎng)時(shí)間保管樣本,希望集中起來(lái)染色,有些可能是染色后排不上隊(duì),想堅(jiān)持長(zhǎng)時(shí)間質(zhì)量穩(wěn)定。于是就這么口口相傳下來(lái)了。
做科研或臨床時(shí),可能很多FLOWER習(xí)氣性都會(huì)用4%多聚甲醛預(yù)先固定標(biāo)本,可能出于三個(gè)目的: (1)為了滅活標(biāo)本里面可能存在的微生物(細(xì)菌、病毒等),起到安全保證作用。 (2)希望標(biāo)本能夠較長(zhǎng)時(shí)間存放 (3)做胞內(nèi)染色前的準(zhǔn)備。 但是,可能很多人忽視了一點(diǎn),就是假設(shè)在染色之前用多聚甲醛固定標(biāo)本,細(xì)胞表面有些位點(diǎn)在固定后構(gòu)象發(fā)作改動(dòng),使得抗體無(wú)法別離產(chǎn)生假陰性,也可能由于固定作用,招致其它位點(diǎn)產(chǎn)生非特異性別離(假陽(yáng)性)。
因此,知道哪些抗體染色前不能預(yù)固定貼心的技術(shù)人員曾經(jīng)幫我們做了一系列測(cè)試,下面兩張表,一張是人類(lèi)抗原,一張是小鼠抗原,可以看的出來(lái),大多數(shù)不能做預(yù)固定的抗體都是趨化因子受體,所以,大家在實(shí)驗(yàn)中千萬(wàn)要留意不要先固定后染色。
表1、4%多聚甲醛預(yù)固定對(duì)各種抗體表面染色的影響(人類(lèi)),打勾的為允許預(yù)固定,打叉的表示預(yù)固定影響很大
表2、4%多聚甲醛預(yù)固定對(duì)各種抗體表面染色的影響(小鼠),打勾的為允許預(yù)固定,打叉的表示預(yù)固定影響很大
染色后的固定,就與抗原構(gòu)象關(guān)系不大了,更多的是熒光素。以前4色以?xún)?nèi)的時(shí)分,用的熒光素都是非串聯(lián)的,因此大多數(shù)影響不大,但隨著各種新型串聯(lián)染料的呈現(xiàn),多聚甲醛固定就成了問(wèn)題了。
事實(shí)上,當(dāng)你去搜索串聯(lián)染色標(biāo)志(如PE-cy7、APC-cy7等)的抗體時(shí),會(huì)發(fā)現(xiàn)一些比較細(xì)致的描畫(huà)里面會(huì)注明(以BD網(wǎng)站搜索APC-cy7各類(lèi)抗體為例):
Fixed cells should be analyzed within 4 hours of fixation in paraformaldehyde or transferred to a paraformaldehyde-free buffer for overnight storage.
意義就是用多聚甲醛固定過(guò)的樣本,必需在4小時(shí)內(nèi)檢測(cè),否則容易招致串聯(lián)染料降解,若要長(zhǎng)時(shí)間保管,還是需求洗濯后,轉(zhuǎn)移到不含多聚甲醛的緩沖液中。
需求留意的是,做GFP熒光檢測(cè)的同窗,也需求留意一下,多聚甲醛固定也會(huì)影響GFP,New York Medical College的Paul A Lucas以為是由于多聚甲醛固定后,并非使GFP熒光淬滅,而是使GFP蛋白構(gòu)象發(fā)作改動(dòng),無(wú)法產(chǎn)生熒光。有時(shí)分你固定后檢測(cè)到的熒光可能是自發(fā)熒光,或剩余的未被改動(dòng)構(gòu)象的GFP發(fā)出的。
1、假設(shè)檢測(cè)的是前述表格中容易被多聚甲醛影響的分子,請(qǐng)盡量不要預(yù)固定,如需長(zhǎng)期保管樣本,可以思索凍存單個(gè)核細(xì)胞。
2、假設(shè)檢測(cè)的是前述表格中不會(huì)受多聚甲醛影響的分子,可用1%多聚甲醛預(yù)固定保管,但FSC、SSC和熒光強(qiáng)度影響較大,如需避免此類(lèi)缺陷,可思索流式中文網(wǎng)研發(fā)的細(xì)胞保管液。流式中文網(wǎng)的細(xì)胞保管液不含多聚甲醛,具有緩釋輕柔的固定作用,故保管更耐久,效果更佳,樣本:保管液=6:1~10:1,21~28天內(nèi)檢測(cè)均可獲得良好的檢測(cè)結(jié)果。
3、假設(shè)希望在染色后堅(jiān)持較長(zhǎng)時(shí)間熒光穩(wěn)定,仍首選建議:避光、4度,在我們非正式的10色(BV405、KO、FITC、PE、ECD、PE-cy5.5、PE-cy7、APC、APC-A700、APC-cy7)流式檢測(cè)時(shí),曾經(jīng)測(cè)過(guò)數(shù)例,在避光、4度保管24小時(shí)后,熒光強(qiáng)度幾乎無(wú)變化,細(xì)胞分群良好。 假設(shè)仍不放心,可思索置辦商品化的適用于串聯(lián)染料的專(zhuān)用固定劑。
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